К основным реакциям процессинга относятся:

1. Удаление с N-конца метионина или даже нескольких аминокислот специфичными аминопептидазами.

2. Образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина.

3. Частичный протеолиз – удаление части пептидной цепи, как в случае с инсулином или протеолитическими ферментами ЖКТ.

4. Присоединение химической группы к аминокислотным остаткам белковой цепи:

фосфорной кислоты – например, фосфорилирование по аминокислотам Серину, Треонину, Тирозину используется при регуляции активности ферментов или для связывания ионов кальция,

карбоксильной группы – например, при участии витамина К происходит γ-карбоксилирование глутаматав составе протромбина, проконвертина, фактора Стюарта, Кристмаса, что позволяет связывать ионы кальция при инициации свертывания крови,

метильной группы – например, метилирование аргинина и лизина в составе гистонов используется для регуляции активности генома,

гидроксильной группы – например, образование гидроксипролина и гидроксилизина необходимо для созревания молекул коллагена при участии витамина С,

йода – например, в тиреоглобулине присоединение йода необходимо для образования предшественников тиреоидных гормонов йодтиронинов,

5. Включение простетической группы:

углеводных остатков – например, гликирование требуется при синтезе гликопротеинов.

гема – например, при синтезе гемоглобина, миоглобина, цитохромов, каталазы,

витаминных коферментов – биотина, ФАД, пиридоксальфосфата и т.п.

6. Объединение протомеров в единый олигомерный белок, например, гемоглобин, коллаген, лактатдегидрогеназа, креатинкиназа.

Фолдинг белков

Фолдинг – это процесс укладки вытянутой полипептидной цепи в правильную трехмерную пространственную структуру. Для обеспечения фолдинга используется группа вспомогательных белков под названиемшапероны (chaperon , франц. – спутник, нянька). Они предотвращают взаимодействие новосинтезированных белков друг с другом, изолируют гидрофобные участки белков от цитоплазмы и "убирают" их внутрь молекулы, правильно располагают белковые домены.

В целом шапероны способствуют переходу структуры белков от первичного уровня до третичного и четвертичного.

При нарушении функции шаперонов и отсутствии фолдинга в клетке формируются белковые отложения – развивается амилоидоз . Насчитывают около 15 вариантов амилоидоза.

Трансляция является хорошей мишенью для лекарств

Многие вещества обладают способностью связываться с элементами рибосом или другими факторами трансляции. Некоторые из этих веществ используются в качестве лекарственных средств, которые в состоянии действовать на разных уровнях трансляции, например:

1. Инактивация факторов инициации

интерферон активирует внутриклеточные протеинкиназы, которые, в свою очередь, фосфорилируют белковый фактор инициации ИФ-2 и подавляют его активность.

2. Нарушение кодон-антикодонового взаимодействия

стрептомицин присоединяется к малой субъединице и вызывает ошибку считывания первого основания кодона.

3. Блокада стадии элонгации

тетрациклины блокируют А-центр рибосомы и лишают ее способности связываться с аминоацил-тРНК,

левомицетин связывается с 50S-частицей рибосомы и ингибирует пептидил-трансферазу,

эритромицин связывается с 50S-частицей рибосомы и ингибирует транслоказу,

пуромицин по структуре схож с тирозил-тРНК, входит в А-центр рибосомы и участвует в пептидил-трансферазной реакции, образуя связь с имеющимся пептидом. После этого комплекс пуромицин‑-пептид отделяется от рибосомы, что останавливает синтез белка.

(от позднелат. modificatio-изменение) биогенная, происходит после завершения трансляции матричной рибонуклеиновой к-ты, или мРНК, (синтез белка на мРНК-матрице) или до ее завершения. В первом случае М.б. наз. п о с т т р а н с л я ц и о н н о й, во втором -к o т р а н c л я ц и о н н о й. Осуществляется благодаря реакциям разл. функциональная группаминокислотных остатков, а также пептидных связей и обусловливает конечную форму белковой молекулы, ее физиологический активность, стабильность, перемещения внутри клетки.

Внеклеточные (секретируемые) белки, а также мн. белки цитоплазматич. мембраны и разл. внутриклеточных ком-партментов (обособленных участков клетки) подвергаются гликозилированию, в результате к-рого образуются глико-протеины. Наиб. сложно организованы маннозосодержащие цепи, присоединенные к полипептидам N-гликозидной связью. Начальная стадия формирования таких цепей протекает котрансляционно по схеме:

Dol-долихол (полипренол), Dol-Р-Р-долихолпирофосфат, Glc-глюкоза, GlсNАс-N-ацетил-D-глюкозамин, Маn-манноза

Послед. стадии осуществляются посттрансляционно с участием неск. ферментов, локализованных в разных субклеточных компартментах. Так, для G-белка вируса везикулярного стоматита, гликозидные цепи к-рого построены из 15 углеводных остатков, установлена такая последовательность событий. Сначала в эндоплазматич. ретикулуме происходит в две стадии отделение терминальных остатков глюкозы с участием двух разных глюкозидаз. Затем ман-нозидазы (I и II) удаляют 6 остатков маннозы, а N-ацетил-D-глюкозаминтрансфераза осуществляет присоединение трех остатков GlcNAc к остаткам маннозы гликопротеина. Наконец, в комплексе Гольджи с этими остатками связываются с участием соответствующих трансфераз остатки фукозы, галактозы и сиаловой к-ты. Моносахаридные остатки могут подвергаться фосфорилированию, сульфированию и др. модификациям.

Гликозилированию секретируемых белков предшествует протеолитич. процессинг - отделение от N-конца поли-пептидной цепи "сигнальной" последовательности аминокислот. В эукариотич. клетках (клетки всех организмов, за исключением бактерий и синезеленых водорослей) этот процесс осуществляется контрансляционно, в прокариотич. клетках (клетки бактерий и синезеленых водорослей) он может протекать посттрансляционно. Наиб. распространенные сигнальные последовательности включают 23 аминокислотных остатка. Характерные особенности этих последовательностей -наличие на конце короткого положительно заряженного участка, за к-рым следует гидрофобный участок, содержащий от 7 до 14 аминокислотных остатков. Сигнальные последовательности завершаются консервативным по длине (5-7 остатков) гидрофильным участком, на С-конце к-рого чаще всего находятся остатки аланина, глицина, серина, треонина, цистeина или глутамина.

Почти все функцион. классы внеклеточных белков (ферменты, гормоны, иммуноглобулины и др.) содержат ди-сульфидные связи. Они образуются из групп SH цистенна в ходе многостадийного процесса с участием фермента ди-сульфидизомеразы. На его ранних стадиях появляется значит. кол-во "неправильных" дисульфидных мостиков, к-рые ликвидируются в результате тиол-дисульфидного обмена, в к-ром, по-видимому, участвует цистамин (H 2 NCH 2 CH 2 S) 2 . Предполагают, что такой "перебор" связей происходит до тех пор, пока не возникает наиб. стабильная третичная структура, в к-рой дисульфидные мостики "захоронены" и вследствие этого недоступны реагентам.

К наиб. распространенным модификациям внутриклеточных белков относятся фосфорилированис и дефосфорилиро-вание по группе ОН остатков серина, тирозина и треонина, к-рые осуществляются с участием ферментов протеинкиназ и фосфатаз по схеме:

АТФ - аденозинтрифосфат, АДФ - аденозиндифосфат, Р -фосфорная к-та или ее остаток

Фосфорилирование сопровождается активацией или инактивацией ферментов, напр. гликозилтрансфераз, а также изменением физико-химический св-в неферментных белков. Обратимое фосфорилирование белков контролирует, напр., такие важные процессы, как транскрипция и трансляция, метаболизм липидов, глюконеогенез, мышечное сокращение.

Белки митохондрий и хлоропластов, кодируемые ядерными ДНК, имеют на N-конце избыточные аминокислотные последовательности, к-рые избирательно направляют полипептидные цепи в определенные компартменты органелл, после чего отщепляются в результате протеолиза с участием специфич. эндопептидаз. Избыточные последовательности предшественников митохондриальных белков существенно различаются по кол-ву аминокислотных остатков; их может быть от 22 до 80. Короткие последовательности характеризуются высоким (20-25%) содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков, равномерно расположенных по полипептидной цепи. Длинные последовательности включают дополнительно участок, состоящий из гидрофобных аминокислот, к-рый "заякоревает" предшественник в липидном бислое митохондриальных мембран.

Известны предшественники для ряда гормонов (напр., для гастрина, глюкагона и инсулина), к-рые переходят в активную форму посредством расщепления полипептидной цепи в участках, содержащих два последовательно расположенных остатка основных аминокислот (аргинин и лизин). Расщепление осуществляется с участием специфич. эндопептидазы, действующей в ансамбле со вторым ферментом, имеющим карбоксипептидазную активность. Последний удаляет остатки концевых основных аминокислот, завершая превращ. пептида в активный гормон. К белкам, подвергающимся протеолитич. активации, относятся также протеиназы (пепсин, трипсин, химотрипсин), альбумины, проколлаген, белки системы свертывания крови и др. В нек-рых случаях неактивные формы ферментов (зимогены) необходимы для временной "консервации" ферментов. Так, зимогены трипсина и химотрипсина (соотв. трипсиноген и химотрипсиноген) синтезируются в поджелудочной железе, секретируются в тонкий кишечник и только там под действием специфич. ферментов превращ. в активную форму.

Широкий круг белков (гистоны, миозин, актин, рибо-сомальные белки и др.) метилируются посттрансляционно по остаткам лизина, аргинина и гистидина (N-метилирова-ние), а также по остаткам глутаминовой и аспарагиновой к-т (О-метилирование). В качестве метилирующего агента обычно выступает S-аденозилметионин .

В нек-рых эукариотич. клетках более половины р-римых белков ацетилированы по N-концу. Этот процесс может осуществляться ко- и посттрансляционно (на схеме обозначено соотв. К. Т. и П. Т.), напр.:

HSCoA-кофермент А, АсСоА - ацетилкофермент A, Met-метионин, Asp - аспарагиновая к-та

Для пептидов, содержащих от 3 до 64 аминокислотных остатков и секретируемых в разл. органы(гастрин, секретин, холецистокинин и др.), обнаружено посттрансляц. амидиро-вание остатка С-концевой аминокислоты (за исключением концевых остатков аргинина и аспарагина).

Нек-рые типы модификаций характерны для отдельных белков или небольших групп белков. В частности, в коллагене и неск. др. белках со сходными аминокислотными последовательностями обнаружены 4- и 3-гидроксипролин, а также 5-гидроксилизин. Гидроксилирование остатков про-лина и лизина протекает котрансляционно и имеет важное значение для формирования уникальной структуры коллагена. Гидроксилизин участвует в образовании ковалент-ных сшивок между полипептидными цепями коллагена по схеме:

Ядерные белки (гистоны, негистоновые белки) подвергаются аденозиндифосфатрибозилированию и полиаденозин-дифосфатрибозилированию, в ходе к-рого аденозиндифос-фатрибозильные остатки переносятся от кофермента ни-котинамидадениндинуклеотида (НАД) к акцепторным белкам:

Эти две р-ции различны во мн. аспектах. В частности, полиаденозиндифосфатрибозилирование протекает в при-сут. ДНК. Большинство аденозиндифосфатрибозильных групп присоединяется к белкам посредством эфирной связи, образованной группой ОН в положении 5" остатка рибозы и группой СООН С-концевой аминокислоты или глутаминовой к-ты, находящейся внутри полипептидной цепи.

Большое значение имеет карбоксилирование остатков глутаминовой к-ты с образованием g-карбоксиглутаминовой к-ты в предшественнике протромбина. Эта реакция катализируется витамин К-зависимой карбоксилазой, локализованной в мембранах эндоплазматич. ретикулума. Аналогичная реакция протекает при созревании нек-рых др. факторов свертывания крови.

Лит.: Основы биохимии, пер. с англ., т. 1, М., 1981, с. 277-80; Общая органическая химия, пер. с англ., т. 10, М., 1986, с. 543-70; The enzymology of post-translational modification of proteins, v. 1, L.-N. Y., 1980; The biochemistry of glycpproteins and proteoglycans, N. Y.-L., 1980; Cell biology. A comprehensive treatise, v. 4-Translation and the behavior of proteins, N. Y., 1980; Methods in enzymology, v. 106, N.Y., 1984; Hurt E.G., Loon A.P.G.M. van, "Trends in Biochem. Sci.", 1986, v. 11, № 5. n. 204-07. В. Н. Лузиков.

Во многих случаях белки синтезируются в виде предшественников – биологически неактивных молекул.Их функциональная активность проявляется в результате превращений, называемых постсинтетической или посттрансляционной модификацией (процессинг) .

Примеры посттрансляционной модификации белков:

Протеолитическое отщепление N-концевого формилметионина или метионина;

Отщепление сигнальных пептидов;

Частичный протеолиз;

- посттрансляционная модификация белков по аминокислотным радикалам: ковалентное присоединение простетической группы, метилирование радикалов лизина и аргинина, ацетилирование N-концевой аминокислоты, фосфорилирование гистонов и негистоновых белков хроматина, гидроксилирование радикала пролина; присоединение олигосахаридных фрагментов (гликозилирование) к радикалам аспарагина, серина и треонина и т.д.

Выбор правильной структуры белка происходи при участии белков шаперонов . Гидрофобные участки на поверхности глобулы шаперонов-70 взаимодействуют с гидрофобными участками синтезированной цепи, защищая ее от неравильных взаимодействий с другими белками цитозоля. Шапероны-60 участвуют в исправлении пространственной структуры неправильно свернутой или поврежденной цепи.

Мутации в шапероне, входящем в состав хрусталика глаза, приводят к помутнению хрусталика из-за агрегации белков и развитию катаракты.

Транспорт синтезированных белков через мембраны

Синтезированный белок поступает из рибосомы в цитозоль. Если он не используется для нужд самой клетки, т.е. относится к экспортируемым (секретируемым) белкам , то он переносится через мембрану при помощи низкомолекулярных пептидов (15-30 аминокислотных остатков), содержащих гидрофобные радикалы. Это сигнальные пептиды . В мембране формируется канал, через который сигнальный пептид проникает внутрь цистерны эндоплазматического ретикулума, и протаскивает за собой синтезируемую молекулу белка. Под действием сигнальной пептидазы N-концевая сигнальная последовательность отщепляется, а белок через аппарат Гольджи выходит из клетки в форме секреторного пузырька.

РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА

Концентрация многих белков в клетке непостоянна и изменяется в зависимости от состояния клетки и внешних условий. Это происходит в результате регуляции скоростей синтеза и распада белков.

В клетках млекопитающих существуют два вида регуляции биосинтеза белков :

- кратковременная , обеспечивающая адаптацию организма к изменениям окружающей среды;

- длительная, стабильная , определяющая дифференцировку клеток и разный белковый состав органов и тканей.

Наиболее распространенным механизм регуляции синтеза белков является регуляция на уровне транскрипции (образования первичного транскрипта).

Синтез в базальном состоянии называют конститутивным синтезом .

Различают две формы регуляции – индукция синтеза (положительная регуляция) и репрессия синтеза (отрицательная регуляция). Понятия индукции и репрессии предполагают изменение скорости синтеза белка по отношению к исходному (базальному) уровню . Если скорость конститутивного синтеза белка высока, то белок регулируется по механизму репрессии синтеза, и, наоборот – при низкой базальной скорости наблюдается индукция синтеза.

Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моне, в генетическом аппарате бактериальной клетки существуют опероны – отрезки ДНК, содержащие структурные гены определенных белков (цистроны ), и регуляторные участки.

Считывание генетического кода начинается с промотора , расположенного рядом с геном-оператором . Ген-оператор расположен на крайнем отрезке структурного гена. Он либо запрещает, либо разрешает репликацию мРНК на ДНК.

Деятельность оперона контролирует ген-регулятор . Белок-репрессор осуществляет связь опероном и геном-регулятором. Репрессор образуется в рибосомах ядра на мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Он образует комплекс с геном-оператором и блокирует синтез мРНК, а, следовательно, и белка. Репрессор может связываться с низкомолекулярными веществами – индукторами, или эффекторами. После этого он теряет способность связываться с геном-оператором, ген-оператор выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это индукция синтеза (рис. 14).

У эукариот механизмы регуляции синтеза белка более сложные. Преобладают положительные регуляторные механизмы. Основной регуляторной точкой является стадия инициации транскрипции. Регуляторные элементы, стимулирующие транскрипцию, называют энхансерами , а подавляющие ее – сайленсерами . Они могут располагаться как рядом с промотором, так и на удалении от него, и избирательно соединяться с белками-регуляторами : энхансеры – с белками-индукторами , сайленсеры – с белками-репрессорами . Процесс взаимодействия регуляторных элементов с белками-регуляторами регулируется сигнальными молекулами – гормонами, некоторыми метаболитами.

Знание особенностей структуры и функционирования рибосом прокариот и эукариот позволило разработать новые типы антибиотиков. Синтез нуклеиновых кислот и белков является ключевым процессом, необходимым для поддержания жизнедеятельности клетки. Если его каким-либо образом выключить - клетка погибнет. Существуют лекарственные препараты, нарушающие синтез пуриновых оснований и аминокислот, синтез нуклеиновых кислот (рис. 16), синтез белка на различных уровнях только в клетках бактерий (таблица 4).

Рис 16. Препараты, нарушающие синтез нуклеиновых кислот

Таблица 4

Средства, угнетающие синтез белков бактериальной клетки

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Генная инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

1. Специфическое расщепление ДНК рестриктазами. В качестве мишеней рестриктаз часто выступают палиндромы из 4-6 пар оснований - сайты рестрикции. Одни рестриктазы вносят разрывы по оси симметрии, образуются так называемые "тупые" концы. Другие - со сдвигом, образуются "липкие" концы, то есть фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в четыре нуклеотида. Такие фрагменты особенно удобны для создания рекомбинантных ДНК.

2. Секвенирование нуклеотидов. С помощью электрофореза фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно. Это позволяет построить рестрикционную карту , на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.

3. Конструирование рекомбинантной ДНК:

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК с помощью рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются «липкие» концы. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу. Если смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами. Затем с помощью лигазы вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК .

Возможны:

- сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод). Комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований. Для восстановления разрывов используют фермент ДНК-лигазу.

- сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод). Тупые концы могут быть соединены ДНК-лигазой. Эффективность реакции ниже, чем при сшивке по липким концам.

- сшивка фрагментов с разноименными липкими концами. Применяют линкеры - химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".

Описанная выше процедура сложна и позволяет получать лишь очень небольшие количества рекомбинантной ДНК.

4. Клонирование (размножение) рекомбинантной ДНК:

- клонирование ДНК in vivo .

Если к культуре Е. coli добавить рекомбинантные плазмиды, то они могут включаться в бактериальные клетки - получаются рекомбинантные бактерии. Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий можно выделить клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них - исследуемый фрагмент ДНК. Таким путем можно выделить ген или любой другой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей.

- аплификация (увеличение числа копий)ДНК in vitro.

В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических праймера. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок называют ампликоном . Амплификация заключается в повторяющихся циклах, представляющих собой трехступенчатый процесс: I - денатурация ДНК при 95 °С; II - отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60 °С); III - последующая достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при температуре 70-75 °С (рис. 17).

Продолжительность одного цикла менее 3 мин. Таким образом, за 2 ч можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности ДНК. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. ПЦР называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning).

С использованием ПЦР разработаны новые диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания. Метод используют для ранней диагностики наличия в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Метод анализа индивидуальных сперматозоидов нашел практическое применение в судебной медицине. С помощью ПЦР удалось амплифицировать и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет.

5. Введение гена в клетку. Ген нужно ввести в клетку таким образом, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, а интегрировался с геномом клетки. Используют 2 способа.

Трансдукция.

Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент и встроить ее в геном.

В состав вектора должен входить маркерный ген , позволяющий селектировать измененные клетки. Можно выделить 2 группы маркерных генов:

- селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам или гербицидам;

- репортерные гены , кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано.

За способность гена к экспрессии отвечают регуляторные последовательности , которые также необходимо встроить в векторную молекулу.

Типы векторов:

- бактериальные плазмиды. Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR 322 создана на основе плазмид, выделенных из E. coli;

- вирусы. Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую;

- гибридные векторы , содержащие ДНК фага и плазмиды - космиды и фазмиды.

2. Прямое введение гена в клетку – трансформация. Ее виды:

Трансфекция. ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Микроинъекция ДНК с помощью микропипеток диаметром 0,1-0,5 микрона и микроманипулятора.

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран.

«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток в митозе колцемидом . Вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Затем их обрабатывают цитохалазином В и центрифугируют. Образуются мини-клетки - микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Для их слияния подбирают специальные мягкие условия.

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.

Метод биологической баллистики является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений. На мельчайшие частички вольфрама напыляется ДНК вектора. Они помещаются внутрь биолистической пушки, откуда с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

С развитием генной инженерии появилась возможность заставить микроорганизмы синтезировать вещества, которые получить другими методами сложно - интерферон, инсулин, соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней.

Плазмиды можно ввести и в клетки эукариот. Генетическая транформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки, что имеет огромное значение для медицинской генетики.

Рассмотрим особенности синтеза тех белков, которые образуются мембраносвязанными рибосомами. Как уже отмечалось это «экспортные», мембранные и лизосомальные белки. Сюда также входят белки пероксисом.

В формировании всех этих белков ключевую роль играют:

Во-первых, гранулярная, или шероховатая ЭПС (эндоплазматическая сеть),

Во-вторых, комплекс Гольджи.

Благодаря этим структурам, происходят два дополнительных (помимо трансляции и фолдинга) процесса:

Специфическая сортировка (вместе с направленным транспортом) и

Модификация новообразованных белков.

2.1. Процессы в гранулярной ЭПС

2.1.1. Структура гранулярной ЭПС

Как известно, ЭПС (эндоплазматическая сеть), или ЭР (эндоплазматический ретикулум), на электронных микрофотографиях выглядит в виде множества мембранных цистерн (мешочков), трубочек и пузырьков.

На самом же деле практически все эти структуры представляют собой единый непрерывныйкомпартмент (отсек), отграниченный мембраной от гиалоплазмы. Этот компартмент образует всевозможные инвагинации и складки, которые и воспринимаются на срезе как отдельные трубочки, пузырьки и расположенные параллельно друг другу плоские цистерны.

Лишь некоторые пузырьки могут быть действительно отшнурованными от данного компартмента. Это «транспортные средства», направляющиеся с порцией новосинтезированных белков к комплексу Гольджи для дальнейших процессов сортировки и модификации.

ЭПС подразделяется на гладкую и гранулярную(шероховатую). Особенность последней состоит в том, что со стороны гиалоплазмы она покрыта рибосомами,что и придает ей характерный шероховатый вид. Эти рибосомы и называются мембраносвязанными- в отличие от свободных, находящихся в гиалоплазме.

Таким образом, при образовании «экспортных» и других рассматриваемых белков (мембранных, лизосомальных, пероксисомальных) трансляция происходит на гранулярной ЭПС.

По некоторым данным, имеет значение и локализация этой ЭПС: «экспортные» белки синтезируются в одних областях гранулярной ЭПС, мембранные белки - в других, лизосомальные - в третьих.

В то же время используемые при этом рибосомы ничем не отличаются от свободных рибосом. Мембранносвязанными они становятся только в процессе трансляции. Вне данного процесса рибосомы находятся в виде отдельных субъединиц. А объединение последних происходит только при инициации трансляции, т. е. при образовании комплекса с мРНК и инициирующей аа-тРНК.

Поэтому, говоря как о свободных, так и о мембраносвязанных рибосомах, подразумевается, что те и другие находятся в состоянии трансляции, и, следовательно, связаны с мРНК и синтезируемым пептидом. При этом нередко рибосомы входят в состав полисом - также свободных или мембраносвязанных.

Отдельные же субъединицы рибосом с ЭПС никогда не связаны.

Рассмотрим особенности трансляции на гранулярной ЭПС с учетом этих замечаний.

2.1.2. Особенности трансляции

При трансляции «экспортных» и других подобных (по механизму синтеза) белков встают две проблемы:

Связывание начавшей трансляцию свободной рибосомы с мембраной ЭПС (причем, видимо, в определенной области ЭПС);

Проникновение синтезируемого пептида во внутреннее пространство ЭПС.

В решении обеих этих проблем ключевую роль играет т. н. сигнальная последовательность (СП) (рис.2.1), с которой всегда начинается первичная полипептидная цепь любого рассматриваемого здесь белка.